骨髓间充质干细胞分离培养及诱导破骨细胞实验流程
骨髓间充质干细胞的提取与分离
1. 样本采集：无菌条件下，对实验动物（如小鼠）进行麻醉后，暴露股骨或胫骨，用注射器从骨髓腔中抽取骨髓液，注入含肝素或EDTA抗凝剂的无菌试管中。
2. 稀释过滤：将骨髓液与等体积的PBS混合，通过40µm细胞滤器过滤，收集到离心管中。
3. 密度梯度离心：在离心管中加入密度梯度介质，缓慢加注稀释的骨髓液，400g离心20分钟。离心后用移液器吸取中间的单个核细胞层，转移到干净离心管中。
4. 洗涤细胞：加入10ml PBS洗涤，400g离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤1 - 2次。
5. 细胞接种培养：将沉淀的单个核细胞重悬于含10 - 20%FBS的DMEM培养基中，按1 - 2×10⁶cells/cm²的密度接种到细胞培养瓶中，放入37°C、5%CO₂培养箱中培养。24 - 48小时后，更换培养基以移除未贴壁的细胞，此后每2 - 3天更换培养基，直到细胞达到70 - 80%的融合度。
骨髓间充质干细胞诱导分化为破骨细胞
1. 细胞准备：当骨髓间充质干细胞达到一定融合度后，用胰酶消化并收集细胞，以合适的密度接种到新的培养容器中，如24孔板，培养基为含20 - 50ng/mL M - CSF的α - MEM培养基。
2. 诱导分化：细胞接种12小时后，更换为含有20 - 50ng/mL M - CSF和50 - 100ng/mL RANKL的10%FBS的α - MEM培养基，此后每隔一天换液，诱导6 - 8天。
3. 破骨细胞鉴定：诱导结束后，按照TRAP染色试剂盒说明书对细胞进行染色，在显微镜下观察，具有三个或更多细胞核且呈深红色至紫色的TRAP阳性细胞即为破骨细胞。
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