线粒体自噬机制、自噬性分泌、炎症反应

研究背景

线粒体质量控制(MQC)对于维持线粒体稳态和细胞的正常生理功能至关重要。在哺乳动物细胞中，MQC通过：线粒体蛋白的泛素化和蛋白酶体降解、自噬和线粒体衍生囊泡(MDVs)来实现。通过自噬体-溶酶体途径（称为线粒体自噬）选择性降解线粒体可能是清除受损或功能失调线粒体最重要的途径。PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，通过清除受损的线粒体，是MQC的关键机制之一。mATG8（mammalian ATG8s）的脂质化（lipidation）是自噬过程的关键步骤，然而其在线粒体自噬过程中的作用仍有待进一步的研究。

研究成果

2022年6月28日，澳门大学/新加坡国立大学沈汉明团队在《Nature Communications》（IF 17.694）杂志上发表题为“A degradative to secretory autophagy switch mediates mitochondria clearance in the absence of the mATG8-conjugation machinery”的文章。研究表明，受损的线粒体通过自噬性分泌排出胞外，作者将此过程命名为Autophagic Secretion of Mitochondria（ASM）。当细胞mATG8偶联机制功能失调时，ASM是MQC中的一种机制，参与炎症反应。

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研究过程与结果

1.mATG8偶联系统不是PINK1-PARKIN介导的线粒体清除所必需的

在WT细胞中，A/O（寡霉素）处理使线粒体去极化，并激活PINK1-Parkin通路，导致线粒体蛋白的时间依赖性顺序降解。从mitoGFP中释放游离的GFP片段证实了线粒体进行溶酶体降解。目前已知，OMM（线粒体外膜）蛋白可被脲蛋白酶体系统快速降解，而不依赖于自噬小体-溶酶体途径。作者在WT和ATG7-KO细胞中发现了类似的OMM蛋白降解模式，表明mATG8偶联系统不是PINK1-PARKIN介导的线粒体清除所必需的（图1）

2. 清除受损线粒体需要mATG8偶联系统上游的关键ATG组件

在A/O处理下，敲除PINK1，阻止了Ub（PINK1靶向泛素）在Ser65位点(一个成熟的PINK1依赖的磷酸化位点)的磷酸化。在用A/O处理的PINK1-KO细胞中，线粒体清除几乎完全被阻断。与WT和ATG7-KO细胞相比，ATG9A-KO细胞中线粒体标志物的降解显著被抑制，细胞中FIP200的敲除显著损害了线粒体蛋白的降解。表明参与mATG8偶联系统上游的自噬小体生物发生的关键ATG组件，仍然是PINK1-Parkin介导的线粒体清除所必需的（图2）。

3. 受损线粒体通过与小型EVs（细胞外囊泡）不同途径分泌

实验表明ATG7-KO细胞在线粒体损伤条件下分泌的线粒体和溶酶体含量高于WT细胞（图3）。从A/O处理的ATG5-KO或ATG3-KO细胞中观察到线粒体标志物的增加。ATG7-KO细胞的EV部分在线粒体损伤时含有Ser65p-Ub（线粒体受损标志）、IMM（线粒体内膜）和基质蛋白，表明ATG7-KO细胞线粒体分泌增加。ATG7-mKO小鼠血清EV部分的线粒体标记物水平显著升高。通过实验证实分泌的线粒体和小型EVs是不同的群体（图4）。

4. 线粒体分泌通过分泌性自噬发生

研究证明线粒体确实被WT和ATG7-KO细胞中完整的自噬体隔离。在ATG7-KO细胞中敲除ATG9A（已被证明介导自噬体形成）可阻断线粒体分泌。在基础条件下，RAB7A缺失显著增加线粒体标记物的分泌，而线粒体损伤时线粒体分泌不受影响。受损的线粒体可通过分泌自噬途径从细胞中挤出，这一介导mATG8脂化独立于ATG7的过程，称为线粒体自噬分泌(ASM)。

5. 抑制ASM会损害线粒体清除

与ATG7-KO细胞相比，ATG14/ATG14/ATG7-DKO或FIP200/ATG7-DKO细胞中IMM和基质蛋白的降解明显受到抑制。用SBI-0206965抑制ULK1可以抑制经A/O处理的ATG7-KO细胞中的线粒体清除。此外，当ATG7-KO细胞中，ATG9A缺失时，A/O处理后线粒体标志物降解显著被抑制。相反，RAB7A缺失并不影响ATG7-KO细胞EV的线粒体降解。表明当mATG8偶联系统存在缺陷时，ASM作为一个MQC通路存在于清除功能失调的线粒体。（图6）。

7. 先天免疫cGAS-STING通路被ASM有效激活

添加来自 ATG7KO 细胞的 EV 导致 cGAS-STING通路激活，STING依赖性促炎基因（IL6，IL8，IFNB1，CXCL10，IFIT1）的表达显著升高。与ATG7-KO细胞相比，当与从ATG14 / ATG7-DKO细胞分离的EV一起孵育时，来自受体细胞的STING依赖性基因和IL6分泌的表达显著降低（图7）。证实cGAS-STING通路可被ASM有效激活。

总结

作者提出了一个依赖于分泌性自噬的MQC通路，将这一过程称之为ASM（图8）。作者发现在PINK1-Parkin线粒体自噬过程中，如果没有mATG8偶联机制，线粒体可以从细胞中清除，但仍依赖于参与自噬小体生物发生的上游ATG蛋白。且在没有mATG8偶联系统的情况下，线粒体清除被发现归因于其通过分泌性自噬在细胞外的释放。ASM通过激活cGAS-STING通路引起受体细胞的促炎反应。

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