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免疫印迹(Western blot)检测

应用简介 蛋白质免疫印迹法(WesternBlot),简称WB,是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开,然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上,利用抗原抗体的特异性结合,用特异性的一抗结合目标蛋白,用HRP标记的二抗结合一抗,再加以ECL发光液显色,检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的

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应用简介
       蛋白质免疫印迹法(WesternBlot),简称WB,是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开,然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上,利用抗原抗体的特异性结合,用特异性的一抗结合目标蛋白,用HRP标记的二抗结合一抗,再加以ECL发光液显色,检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析,还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。WB技术现已广泛应用于蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个研究领域。
技术原理
       通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜或PVDF膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应(目前主要用HRP标记的第二抗体),经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分(目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光,通过仪器或者胶片显色)。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验方法

 
常见问题
       1、WB有什么优点?
       灵敏,可达ng级,用ECL显色法可达pg级。灵敏,相对便宜且特异性高。
       2、细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢?
       有沉淀可能因为蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS的浓度,同时将样品煮沸时间延长,一般需96℃以上10-15min左右;也不排除抗原浓度过高,这时需再加入适量上样缓冲液。
       3、胶片背景很脏,有什么解决方法?
       减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜,此孵育条件比37℃1h要温和很多),并提高封闭液浓度。
       4、目标带是空白,周围有背景,是为什么?
       一抗浓度较高,二抗上HRP催化活力太强,同时显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新进口的显色底物。
       5、电泳中常出现的一些现象:
       ①“︶”条带呈笑脸状
原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高,而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形,所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。
       ②“︵”条带呈皱眉状
       原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。
       ③条带拖尾
       原因:样品溶解不好,或存在一定程度地蛋白降解。
       ④纹理(纵向条纹)
       原因:样品中含有不溶性颗粒,可能抽提蛋白时出了问题。
       ⑤条带偏斜
       原因:电极不平衡或者加样位置偏斜,一定要子平面台子上电泳,胶要做好。
       ⑥条带两边扩散
       原因:加样量过多,弥散至孔周围了,减少上样量或者使用5X上样缓冲液。