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CRISPRCas9技术

应用简介 简单来讲,CRISPR/Cas9是一种分子生物学技术,通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术,对生物体内的遗传物质进行修改。基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR/Cas9技术只包含两种重要的成分,一种是行使DNA双链切割

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应用简介
       简单来讲,CRISPR/Cas9是一种分子生物学技术,通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术,对生物体内的遗传物质进行修改。基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR/Cas9技术只包含两种重要的成分,一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,而另一种则是具有导向功能的sgRNA(single guide RNA)。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时,Cas9蛋白通过与sgRNA结合,靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后,引发细胞内部的DNA修复机制(DNA repair)。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下,断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复,而在非同源重组修复下,断裂出的DNA随机修复,引入新的碱基,使基因产生移码突变。
技术原理
       CRISPR/Cas9系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA,从而实现对基因组DNA序列进行编辑;而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA),用以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
       靶位点的选择要求:
       1、靶位点主要包括20 个碱基,并且这20个碱基后面是NGG的PAM 区;
       2、靶位点尽量选择在基因编码区的前端;
       3、转化应选择对应抗性的LB平板培养基。
实验方法

技术总结
Crispr/Cas9慢病毒特点: 
1、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验;
2、基因敲除效率比直接质粒转染更高;
3、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体,更易筛选到基因敲除成功细胞;
4、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。
Crispr/Cas9腺病毒特点:
1、可感染多种分裂期和非分裂期细胞,感染效率高、敲除效率高;
2、操作简单,容易掌握;
3、基因敲除周期短,成本低;
4、适合哺乳动物不同种属不同基因的操作,适用范围广。