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Tunel染色

Tunel染色 Tunel染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端,从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法,

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Tunel染色
       Tunel染色即原位末端转移酶标记技术。凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口,产生一系列3’-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下,将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端,从而进行凋亡细胞的检测。TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。
技术原理
       晚期凋亡细胞中染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端,在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的催化下,将带有生物素(Biotin)分子的dUTP,标记到DNA的3'-末端,随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的链酶亲和素Streptavidin(Streptavidin-HRP)结合,最后通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞,这就是Tunel(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。
实验流程

 
 
关键实验步骤
       1.充分脱蜡和水化脱蜡可以先60ºC 20min,再用使用二甲苯两次5-10min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;
       2.把握好细胞通透的时间一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10-30min,几μm切片用短时间;几十μm切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
       3.适当延长TUNEL反应液的时间一般是37ºC1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2h,但要结合你最终的背景着色。
       4.DAB显色条件的选择一般DAB反应10min左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30min;promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色,我不太喜欢。
       5.PBS的充分清洗在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
       6.内源性POD的封闭也十分关键对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。
实验结果展示:

注意事项
       1、洗涤蛋白酶K时,一定要PBS冲洗3次,如果冲洗不净会严重干扰后续的标记反应;
       2、3%的过氧化氢溶液孵育时间不应过长,否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂,产生假阳性;
       3、滴加Tunel检测液时,可利用防蒸发膜防止其蒸发影响样本的生物素标记;配制好的DAB显色液必须一次性使用完毕,不宜冻存。
常见问题
       无/弱染色?
       烤片温度过高,推荐56℃-60℃1-2h;
       一抗是否适用固定液和石蜡切片,使用浓度是否过低,孵育是否时间过短等。
       染色过深?
       染色试浓度过高或孵育时间过长;
       显色剂浓度过高或孵育时间过长。
       送样运输要求:
      1、石蜡切片常温、组织由标准的石蜡包埋盒包埋,石蜡与组织要均匀接合,不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定,有效厚度至少要超过0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块,超过半年的蜡块抗原可能丢失,做免疫组化可能出现检测不到蛋白。
      2、冰冻切片-20℃、固定后细胞爬片4℃。