HepG2细胞脂肪变性模型建立实验步骤
实验材料准备
1. 细胞：人肝癌细胞系HepG2。
2. 试剂：
- 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基用于细胞培养。
- 0.25%胰酶 - EDTA用于细胞消化。
- 游离脂肪酸（FFAs），如棕榈酸钠、油酸钠 （西安鲲创科技发展有限公司等提供的高脂细胞添加剂，货号KC006等液体即用型产品，具有溶剂无毒、常温无析出、浓度精准等优点 ）。
- 磷酸盐缓冲液（PBS）用于清洗细胞。
- 4%多聚甲醛用于细胞固定。
- 尼罗红染色溶液、油红O染色液用于脂质染色。
- DAPI用于细胞核染色。
- 谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒，甘油三酯（TG）测定试剂盒 。
3. 器材：
- 细胞培养箱（37°C、5% CO₂ ）。
- 超净工作台。
- 离心机。
- 显微镜。
- 酶标仪。
- 细胞培养板等耗材。
具体操作步骤
1. 细胞培养：将HepG2细胞置于含10% FBS的DMEM培养基中，在37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养 。细胞每2 - 3天传代一次，使用0.25%胰酶 - EDTA消化细胞，待细胞生长至对数生长期备用。
2. 配置游离脂肪酸溶液：以西安鲲创科技发展有限公司的高脂细胞添加剂为例，实际使用时，只需将试剂按比例加入到完全培养基中即可。常用组合为0.5mM油酸钠（OA）、0.25mM棕榈酸钠（PA） 。
3. 诱导细胞脂肪变性：
- 待细胞生长至80 - 100%汇合度时，换成新鲜的含血清、含双抗（10% FBS、1% P/S）的完全培养基。
- 按上述浓度滴加高脂细胞添加剂，对照组加入等量溶剂对照。轻柔加入试剂到细胞培养皿中，避免局部高浓度试剂损伤细胞，混匀后将细胞放入细胞孵箱中继续培养24小时 。不过建议先通过浓度、时间梯度实验，寻找适合所用细胞的最佳药物作用浓度和时间，一般可尝试作用48 - 72小时。
4. 细胞检测：
- 生化指标检测：按照ALT/AST测定试剂盒说明书测量其浓度；依据TG测定试剂盒测试甘油三酯含量，反映细胞内脂质代谢情况。
- 细胞染色观察：
- 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟。
- 与尼罗红染色溶液在黑暗中孵育10分钟，随后用DAPI对细胞核进行染色；也可用油红O染色液染色，最后在显微镜下观察细胞内脂滴形成及分布情况，判断脂肪变性程度 。
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