问题一：高背景或阴性对照值偏高
【原因】
1. 阴性对照孔被阳性对照或样品污染
2. 抗体非特异性结合
3. 酶结合物过浓
4. 孵育温度过高
5. 底物在使用前曝光
6. 读板前停留时间过长
【建议】
1. 洗涤时，勿将洗液溢出孔外
2. 封闭液不适合，更换封闭液
3. 检查酶结合物是否按照说明书规定比例稀释
4. 检查孵育箱的温度是否正确、稳定
5. 应保存在暗处，避光
6. 加终止液后3分钟内读板
问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
【原因】
1. 试剂未平衡至室温
2. 检测体积偏小
3. 孵育时间过短
4. 底物受污染
5. 包装袋中有湿气
6. 样本中有抑制剂
【建议】
1. 实验开始前，将试剂盒从冰箱取出平衡至室温
2. 检查移液器吸液管道是否堵塞
3. 使用计时器，准确孵育时间
4. 使用新配置的试剂，重新实验
5. 检查袋中是否有干燥剂（叠氮钠会抑制HRP酶的活性）
问题三：边缘效应
【原因】
1. 蒸发
2. 温度不均匀
【建议】
1. 各个步骤之间，须使用封版胶密封反应板
2. 校准孵育箱，勿叠放反应板
问题四：重复性较差
【原因】
1. 微孔中有气泡
2. 试剂未混匀
3. 样本中有杂质或沉淀物
4. 微孔包被面被吸头划破
5. 使用用过的封板胶纸
【建议】
1. 用针尖挑破气泡
2. 确保充分混匀试剂
3. 使用前离心
4. 加液时小心操作
5. 每次须使用新的封板胶封住反应孔
问题五：标准曲线不佳
【原因】
1. 倍比稀释标准品时未混匀
2. 过早稀释标准品
3. 加入的体积不正确
【建议】
1. 稀释标准品的每一步均需混匀
2. 标准品在快要使用时稀释
3. 使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中
问题六：标准曲线良好，但样本无检测信号
【原因】
1. 样本中无检测物或检测物含量极低
2. 样本中其他物质影响/掩盖检测
3. 样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值
【建议】
1. 设置内参，重新实验
2. 适当稀释样本，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率
3. 适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内
问题七：整块板OD值偏低
【原因】
1. 显色时间不足
2. 孵育温度偏低
3. 未加终止液
【建议】
1. 适当延长显色时间
2. 36°C为最适反应温度
3. 加入终止液，增强颜色反应的强度，稳定最终的颜色反应
问题八：整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色
【原因】
1. 洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染
2. 结合物浓度过高
3. 血清中有血清因子
4. 底物容器不洁净
5. 底物孵育时，微孔板曝光
【建议】
1. 洗涤时，缓冲液充满至孔边缘，但要确保不能溢出孔外
2. 检查结合物是否按照说明书建议比例稀释
3. 勿加热血清
4. 用酸清洗容器瓶，再用蒸馏水冲洗
5. 加底物后，立即将板置于暗处
问题九：假阳性反应
【原因】
1. 洗涤不充分
2. 洗板机管道堵塞
3. 加结合物时，酒在微孔边缘
4. 检测样本中含有红细胞
5. 微孔中液体挥发
【建议】
1. 使用前检查洗板机是否正常工作
2. 需经常维护洗板机
3. 小心向微孔加入结合物，加入微孔底部中央，避免与孔壁和边缘接触
4. 对检测样本离心
5. 用封板胶密封反应孔，置于湿盒内
问题十：显色缓慢
【原因】
1. 样本未置于室温
2. 酶结合物活性减弱
3. 酶活性受到抑制，如叠氮钠
4. 显色温度不适当
【建议】
1. 实验开始前，将样本平衡至室温
2. 检测酶结合物稀释度
3. 避免实验不当的防腐剂
4. 按说明书调节温度
ELISA实验注意事项
l 每个板的正面和左面写上检测指标名称，确保各个步骤中试剂样品不加反
l 敷育过程中板用封板膜贴上或者用一次性手套包住
l 实验过程中板不能干，如有多个板，可以先甩干，在加样前再拍干
l 板底部也要检查确保干净，甩的时候也要避免孔和孔之间交叉污染
l 每个板的最后一列前两个孔是质控，剩下的都是空自孔
l 试剂盒使用前需从2~8℃冰箱取出，室温平衡至少30分钟
l 浓缩洗涤液若有结晶，需37℃水浴助溶后再稀释
l 生物素化抗体/酶结合物需离心使管壁液体沉底，再轻柔吹打混匀
l 不同批号试剂组分禁止混用，开封后未用完的板条需密封袋保存
l 板条勿叠放，确保各孔受热均匀
l 显色适度后立即加终止液（添加顺序与显色剂一致），避免延迟导致过度显色
l 做好安全防护，终止液含强酸，需戴手套操作
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