实验模型:细胞脑原位接瘤模型
小鼠品系:BALB/c-nu
接瘤方式:脑原位接瘤,n个细胞/只
鼠龄:4-6周龄,16-18g
主要实验器材:10μL微量注射器、脑立体定位仪
实验步骤:
一、 细胞部分
1. 准备仪器和耗材:无菌的0.5mL离心管,1mL、200μL、10μL枪和枪头、胰酶、PBS、1640(或DMEM,无血清),细胞计数板。
2. 细胞消化后离心,弃上清。
3. 加入1mL 1640吹打细胞使其重悬,取10μL细胞悬液,加90μL培养基稀释10倍后计数。
4. 计数后将细胞悬液离心,重新加入适量1640配制细胞密度为2.5×106个/mL的细胞悬液,放于冰中待用。
二、 动物部分
1. 准备仪器和耗材:纸巾、棉签、75%酒精、剪刀、镊子、缝合线和缝合针、1%戊巴比妥钠、1mL注射器、10μL微量注射器、计时器、消炎粉、热垫、脑立体定位仪。
2. 异氟烷麻醉裸鼠或者腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.14mL/20g)麻醉裸鼠(麻醉效果不好),置于脑立体定位仪上,固定好小鼠头部,检查是否固定成功:鼻对正中,头部不动,提尾不掉,目测大脑放置水平。
3. 用剪刀沿头部正中线向耳朵方向纵向切开1-2cm的切口,露出头骨的矢状线和冠状缝合线,找到前囟(Bregma,避免与前囟远端的窦区混淆)。
4. 先用75%乙醇冲洗微量注射器,排出气泡,再用PBS冲洗3-5次。然后吸取2μL细胞密度为2.5×106个/mL细胞悬液,将微量注射器固定在支架上。
5. 把针头移动到前囟点,XY轴归零,然后将X轴移动到××mm,Y轴移动到××mm处,用笔在颅骨的该区域标记标记记号点,用颅骨钻在注射点钻出一个孔(创口尽量小但是又不妨碍实验)。
6. 微调针头到注射点正上方,调整Z轴到前囟点后将Z轴归零。
7. Z轴下降到××mm插入颅内,停留3min,Z轴退针0.5mm,使颅内形成一个小室,在2min内缓慢注入肿瘤细胞,然后每1min退针0.5mm,防止漏液。
8. 用5-0号缝合线缝合头部皮肤,涂抹上消炎粉。将动物放在热垫上,待动物清醒后放回笼内继续观察。
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