细胞量不够？细胞碎片太多？
导致实验一次次重复？盘他！
教你如何把细胞周期的数据
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细胞周期简介
流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法，细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间，它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程。
主要分为以下2大过程：
▲分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；
▲分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。
『 注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；
——因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；
——不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在差异。如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细胞为21小时。』
实验步骤
1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：800rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ulRNaseA（100ug/mL ），4℃避光孵育60min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！
▲有关流式细胞周期结果图解读 ：
流式细胞周期结果图
1.纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
2.横坐标DNAContent：即DNA含量；
3.G1、G2、S三期在图中已经标示；
4.右侧数字含义：Dip G1-38.81% at 68.59，即G1期DNA含量平均值为68.59；即G1期细胞数占总数的38.81%；Dip G2-15.32% at 131.69，即G2期DNA含量平均值为131.69，G2期细胞数占总数的15.32%；以此类推…
流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
常见问题解答
1.是否可以直接用乙醇固定细胞？
不可以，直接70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。正确做法是：待细胞充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为70~75%乙醇。
2.细胞量过少，无法获得数据结果？
▲首先，要保证收集足够的细胞样品（个人经验至少收集100万左右）；如果药物处理后细胞死亡过多，应该降低药物浓度；
▲其次，固定细胞时先用预冷的PBS重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中；
细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片；
▲最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完；
3.什么样的数据结果可以用？
▲G2/M期细胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰；
▲CV(变异系数)表示峰的宽度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被认可。
▲RCS最好是在1~3，高于5则不被认可。RCS高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候RNA酶消化不好，或者是PI的浓度不佳造成的。
4.如何提高分辨率和精确度？
变异系数（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品CV值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分，可以减少样本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精确度。
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