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核酸提取

应用简介 核酸提取是分子生物学的基本组成部分,高质量的核酸在分子生物学上的应用至关重要。核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案(例如:克隆、qRT-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术),获得的核酸可以在分析基础研究和疾病研究中的基因表达、跟踪对药物治疗的反应、识别新物种并

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应用简介
       核酸提取是分子生物学的基本组成部分,高质量的核酸在分子生物学上的应用至关重要。核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案(例如:克隆、qRT-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术),获得的核酸可以在分析基础研究和疾病研究中的基因表达、跟踪对药物治疗的反应、识别新物种并深入了解进化过程、诊断疾病等方面以不同方式进行应用。
技术原理
       核酸具有贮存和传递遗传信息等重要生物功能,是分子生物学研究的主要对象。采用常规吸附柱法抽提样本中的DNA、RNA,为下游实验提供高纯度和高浓度的模板。
DNA提取方法:对基因组DNA的提取方法主要有CTAB,SDS和其他如玻璃珠法,酶法等。质粒DNA的提取主要有碱裂解法和煮沸法;线粒体,叶绿体DNA的提取主要有差速离心结合SDS法。
RNA提取方法:异硫氰酸胍/苯酚法。基本实验原理:细胞在变性异硫氰酸胍作用下裂解,核酸释放。DNA和RNA在特定pH下溶解度不同而分别于体系的中间相与水相,得以分离。进行有机溶剂抽提,沉淀,得到纯净RNA。
实验方法

技术总结
       1、细胞裂解法
       物理方式:煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法
       化学方式:表面活性剂(SDS法)、碱裂解法
       生物方式:酶法(溶菌酶、蛋白酶K等)
       2、常见样本提取方法
       总结浓盐法:利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同,将二者分离。
       有机溶剂提取法:有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用。
       高度梯度离心法:利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物。
       吸附材料结合法:①硅质材料高盐低PH值结合核酸,低盐高PH值洗脱②阴离子交换树脂低盐高PH值结合核酸,高盐低PH值洗脱③磁珠磁珠微粒包裹上不同基因可吸附不同的目的物,从而达到分离目的。
       胍盐提取结合二氧化硅吸附法:二氧化硅具有特异吸附核酸的特性,异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下,从细胞包括细菌或者病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上,利用此特性可提取血液和尿液中的DNA和RNA。
       TRlzol试剂提取RNA:用TRlzol试剂裂解细胞,再加入氯仿,离心后可见三层,上层为透明的水相含有RNA,中间含有DNA,下层为红色的有机相,含蛋白质。
       离心柱提取:离心柱技术是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法,属于硅吸附方法的一种,在原理上可分为三个部分:①利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来。②把释放出来的核酸特异吸附在特定的硅载体上,这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力,对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附,因而离心时被甩出柱子。③把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来,分离得到纯化的核酸。
       磁珠法:依据与硅胶膜离心柱相同的原理,运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性,在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来,可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
常见问题
       洗脱产物DNA量很少或没有?
       样品中细胞浓度低;
       样品裂解不充分;
       DNA吸附不充分。
       DNA影响后续酶反应实验?
       乙醇有残留;空离完成后再将吸附柱置室温或温箱2min左右,彻底去除乙醇。
       核酸降解?
       样本不新鲜(尤其对于RNA而言);
       前处理不当(样本量过大)。