一、获取细胞裂解液
冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendoff管
1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞
用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min
每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃
二、制备磁珠-抗体
重悬磁珠
标记实验所需的eppendoff管
吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管
每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡
将eppendoff管置于磁力架上，去上清，重复一次
用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠
室温孵育30min
将eppendoff管置于磁力架上，弃上清
加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次
加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上
三、RNA结合蛋白免疫沉淀
准备RIP Immunoprecipitation Buffer
将前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml
4℃孵育3h至过夜
短暂离心，将eppendoff管放在磁力架上，弃上清
加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次
四、RNA纯化
准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
55℃孵育30min
孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中
于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡，室温下14,000rpm离心10min
小心吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min
小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜
14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清
用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.
10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存。
文章出自：细胞实验外包 想了解更多请关注：http://www.do-gene.com
